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Abstract: The detection of local similarities between protein structures may give insights for the identification of a common function. Different tools exist which try to elucidate the mechanisms connecting the similarity of local subsets of residues with the biological activity of whole proteins: i) databases of functionally annotated structures and ii) structural comparison algorithms. Both types of tools suffer from two major problems. The first is the low degree of integration among databases containing functional information. The second is the low or absent integration between existing methods for structural comparison and functional annotation resources.

Abstract: Scopo di questo lavoro è lo sviluppo di un programma per calcolatore in grado di predire la specificità di legame di un dominio SH3 sulla base della sola sequenza. Il database di dati cristallografici comprende una decina di complessi SH3/peptide o proteina. Considerando anche dati sull'interazione tra SH3 e peptidi disponibili in letteratura o ricavati da esperimenti di phage display, possiamo costruire una matrice di frequenze di interazioni residuo-residuo tra posizioni nella sequenza degli SH3 e posizioni nella sequenza del ligando. La matrice dei contatti SH3/peptide può essere utilizzata allo scopo di valutare coppie di sequenze SH3/peptide e predire la loro capacità di legame. La matrice delle frequenze dei contatti contiene una quantità di informazione ovviamente limitata dal database di interazioni su cui è costruita, inoltre non contiene punteggi negativi. Abbiamo costruito una seconda matrice SH3 specifica, ottenuta dalla matrice delle frequenze dei contatti arricchita con il metodo dei profili (Gribskov et al., 1987). La matrice dei profili è completamente piena (contiene uno score anche per residui non ancora inclusi nel database SH3/peptidi di partenza) e contiene sia valori positivi che negativi. Entrambe le matrici possono venire usate per produrre funzioni di score e valutare probabilità di legame tra sequenze di domini SH3 e peptidi, sequenze di proteine o intere banche dati di proteine in tempi molto contenuti (circa 30 minuti cpu su una Silicon Graphics R5000 per analizzare l'intera banca dati delle sequenze delle proteine del PDB, circa 14000 sequenze). Il metodo è stato messo a punto nello studio dell'interazione tra SH3 e peptidi, ma può essere facilmente applicato anche allo studio di diversi domini di interazione protein-proteina (domini SH2, PH, MHC etc.). Stiamo al momento valutando le prestazioni del metodo con le due diverse matrici descritte. E' importante sottolineare che, all'aumentare del database che costituisce la base informativa iniziale (con altre strutture e/o con altri dati di interazione provenienti da letteratura o phage display) ci aspettiamo un consistente aumento del potere predittivo del metodo.

Abstract: Abbiamo utilizzato SH3-SPOT per effettuare predizioni tra singole sequenze di SH3 e liste di peptidi, proteine o database di proteine (nrl_3d e swissprot). Le predizioni sono in buon accordo con i dati sperimentali ove questi siano disponibili. Il metodo puo' essere utilizzato per predire la specificita' di qualunque proteina di cui siano disponibili: 1) la struttura di almeno un complesso proteina/peptide o proteina/proteina; 2) dati sperimentali di interazione tra proteina e liste di peptidi. Nel caso del dominio SH3, abbiamo attualmente a disposizione 8 strutture di complessi e circa 300 peptidi che si legano ad una ventina di domini SH3. Il potere predittivo del metodo potrebbe aumentare col crescere del database delle strutture o dei dati di phage display. Stiamo attualmente migliorando il programma con il calcolo dell'entropia per "pesare" i residui dell'interfaccia e con la valutazione della lunghezza delle catene laterali dei residui coinvolti nell'interazione nel calcolo della frequenza dei contatti residuo-residuo.Il nuovo programma SPOT verra' applicato all'analisi della specificita' delle molecole MHC e allo studio dell'interazione DNA-proteine. Barbara Brannetti, Allegra Via, Gianluca Cestra, Gianni Cesareni e Manuela Helmer Citterich (2000). SH3-SPOT: an algorithm to predict preferred ligands of different members of the SH3 gene family. JMB in press.

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Abstract: SH3 domains bind polyproline II peptides characterized by the PxxP consensus (P is proline and x in any amino acid). Single domain specificities display a preference for peptides within a range of variability on the common structural theme and different domains may interact with common peptides. We defined a new neural strategy to extract information from interacting partner sequences to improve the identification of SH3 domains specificity.

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Abstract: Le protein chinasi (PK) sono una classe di enzimi coinvolti nella trasduzione del segnale in grado di fosforilare residui specifici di substrati specifici; per molti di essi sono note sequenze substrato consenso. In funzione del tipo di residuo fosforilabile, le PK si dividono in serina/treonina chinasi e tirosina kinasi; alcune PK, come le MAPKK, mostrano una doppia specificita'. Il nostro scopo e' di confrontare la superficie del sito attivo di un membro di ciascuna sottofamiglia di PK (seguendo la classificazione di SCOP) in modo da mettere in evidenza caratteristiche conservate. L' approccio seguito e' il metodo dei motivi 3D (de Rinaldis et al., JMB 284, 1211-1221, 1998) che permette di utilizzare allineamenti multipli di superfici proteiche per definire motivi tridimensionali associati ad una specifica funzione, che possono essere usati per ricerche in database di strutture proteiche. Questa metodologia consente di definire una ‘signature’ di superficie che caratterizzi la specificita' di legame delle due famiglie di PK, difficilmente rilevabile per mezzo di allineamenti di sequenza. Cio' permettera' inoltre di fare previsioni sulla base strutturale della specificita' di legame di PK per le quali i substrati non siano stati ancora caratterizzati. Inoltre sara' possibile definire un strategia sperimentale per confermare i nostri risultati, mediante delineazione di mutanti (allo scopo di cambiare la specificita' per il legame del substrato di una data PK ). Lo stesso approccio puo' essere utilizzato per confrontare la superficie delle protein fosfatasi, allo scopo di evidenziare residui conservati fra le serina/treonina fosfatasi e le tirosina fosfatasi, e fra protein fosfatasi e PK. La nostra ipotesi e' che tutte le proteine in grado di legare fosfoaminoacidi possano condividere delle similarita' di superficie; altri domini proteici noti per la loro abilita' nel riconoscere fosfoaminoacidi, come gli SH2 e i WW, saranno oggetto di studio nel corso del progetto. Nelle fasi iniziali del progetto, il confronto di un membro per ogni famiglia di PK ha messo in luce residui conservati sulla superficie; molti di essi sono noti per la loro importanza per quanto riguarda catalisi o riconoscimento del substrato. Alcuni sono comuni a tutte le proteine in esame, mentre altri sono specifici per le serina/treonina chinasi o per le tirosina chinasi. Allo stadio attuale stiamo esaminando le interazioni fra le PK e i loro substrati mediante lo studio delle strutture di enzimi co-cristallizati con il substrato o con un inibitore.

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Abstract: Reflecting the modular nature of eukaryotic proteins, several WWW servers (e.g. PFAM, SMART, PROSITE) are dedicated to revealing domains in protein sequences. However, there is no resource, which specifically focuses on short functional motifs (targeting peptides, docking modules, glycosylation sites, phosphorylation sites, etc), yet these modules are just as important for function as the larger protein domains. Domains are identified by conventional methods, such as patterns (regular expressions) profiles or HMM models. But statistically robust methods cannot usually be applied to small motifs, while pattern-based methods over-predict enormously so that the few true motifs are lost amongst the many false positives. ELM (Eucariotic Linear Motifs - http://elm.eu.org) [1] is a new web based tool for the prediction of these small motifs on eukaryotic protein sequences. At the moment, the ELM database contains manually curated information about 114 known linear motifs in the form of regular expressions, profiles or hidden markov models that identify the motifs on the sequence. ELM addresses the over prediction deficiency of other methods by the use of context-based rules and logical filters that exclude false positives. The current version of the ELM server provides core functionality including filtering by cell compartment, phylogeny, globular domain clash (using the SMART/Pfam databases), secondary structure, and solvent accessibility. The current set of motifs is not at all exhaustive. Filters work by comparing the information on the motifs stored in the db (taxonomic, structural and cellular context) with the information submitted by the user together with his sequence. The structural filter works by automatically modeling the submitted protein sequences, whenever a good template is found in the SCOP database, and comparing predicted solvent accessibility values and secondary structure features with the corresponding values associated to ELM matches on true positive structures. The ELM server was launched on November 2002 and regularly enhanced since then. The server activity has been running for several months at > 45,000 hits from > 1700 unique internet sites.

Abstract: Abbiamo sviluppato (De Rinaldis et al., 1998) un programma per calcolatore in grado di generare un profilo tridimensionale a partire da una sovrapposizione di superfici proteiche che condividono la stessa funzione. L'analisi del profilo 3D ricavato da tale sovrapposizione consente: 1) lo studio dei determinanti strutturali di superficie associati ad una determinata funzione biologica; 2) la selezione di proteine con una determinata proprietà funzionale a partire da una banca dati di strutture; 3) l'identificazione di strutture proteiche da utilizzare come possibili "scaffold" di nuove funzioni in seguito a mutagenesi sito-specifica; 4) di indagare la possibilità di costruire due superfici proteiche con caratteristiche chimiche e funzionali simili su fold differenti e di analizzare il database di strutture note per vedere se la selezione naturale abbia mai esplorato questa opportunità attraverso una sorta di evoluzione convergente. Abbiamo applicato la procedura allo studio della tasca di legame dei domini SH2 e SH3 e della superficie associata alla struttura del p-loop. I profili 3D delle tasche di legame dei domini SH2 e SH3 riconoscono tutte le strutture degli SH2 e degli SH3 presenti nel dataset; il profilo associato al p-loop riconosce 17 delle 20 strutture proteiche contenenti un p-loop e presenti nel dataset. L'analisi del profilo 3D del p-loop ha consentito l'identificazione di una carica positiva e di una carica negativa conservata nello spazio, ma non nella sequenza. Stiamo applicando il metodo all'analisi dell'intero database delle proteine a struttura nota (PDB) per identificare funzioni definite eventualmente da pattern di sequenze diversi (motivi diversi nel database PROSITE (Bairoch, 1991; Bairoch et al., 1997), ma che possano invece essere riconosciute da un motivo di superficie unico, definito col metodo dei profili 3D.

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Abstract: Abbiamo sviluppato una procedura (de Rinaldis et al., 1998) per calcolatore che consente di analizzare e confrontare superficie proteiche che siano associate a specifiche funzioni (es.: particolari abilita' di legame o di catalisi). Sulla base di un allineamento multiplo di strutture proteiche omofunzionali ed in analogia con il metodo dei profili per la ricerca di omologie di sequenza (Gribskov et al., 1987), il programma permette di realizzare un profilo 3D che puo' essere usato per fare ricerche nel PDB e selezionare proteine con particolari caratteristiche di superficie e funzionali. L'analisi del profilo 3D consente l'individuazione di residui conservati sulla superficie delle proteine sovrapposte e la definizione di determinanti strutturali associati a particolari funzioni biologiche. Questo metodo puo' inoltre essere utilizzato: i) per identificare strutture proteiche che, pur avendo fold differenti, abbiano una o piu' regioni di superficie con proprieta' chimiche e funzionali simili (evoluzione convergente); ii) come sistema esperto per la mutagenesi sito-specifica o iii) per il protein design. Stiamo utilizzando i profili 3D per analizzare i determinanti di superficie legati a sei motivi del database PROSITE: aminoacyl-transfer RNA sintetasi di classe II, perossidasi , dominio EF-hand di legame al calcio, sito di legame all'eme della famiglia citocromo c, sito di legame a nucleotidi del p loop, sito attivo delle aspartil proteasi eucariotiche e virali. Tali motivi di sequenza non sono in grado di riconoscere tutte e sole le sequenze proteiche associate alla loro funzione, ma selezionano anche falsi positivi e talvolta non selezionano tutte le sequenze cui e' associata la funzione loro assegnata. Nostro scopo e' indagare se invece esista e possa essere identificato un motivo di superficie specifico per ognuna delle funzioni analizzate. Nel caso del p loop, l'analisi dei risultati ha permesso considerazioni di particolare interesse biologico. L'applicazione di questo metodo all'intero database di strutture note potrebbe consentire la realizzazione di una banca dati di motivi di superficie capaci di identificare tutte e sole le strutture associate ad una specifica funzione, in quei casi in cui l'analisi della sola sequenza non lo consentirebbe. Lo sviluppo dei progetti di "structural genomics" rende molto piu' vasto l'insieme delle proteine cui applicare il metodo.

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